《动物手脚实习指南》共674页，涵盖了常睹的实习动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详尽描写了每一种手脚测试的实习打算、测试兴办、实习流程、评估目标、预期结果、常睹题目及处置要领、数据明白、模子利用与限制性等各个方面。它通过急速诱导，助助探讨职员高效地把握实习的每个阶段，省略了查阅文献和寻找要领的时代，成为百般科研职员的紧张参考材料。 《动物手脚实习指南》共计收录了16种动物手脚类型，蕴涵忧虑抑郁、研习追忆、痛觉、运动、惊骇、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼手脚以及常睹动物模子等实质。每一类动物手脚下，都详尽先容了众个经典的实习范式，涵盖了凌驾100种实习要领。
自闭症谱系窒息（ASD）是一种由遗传和处境成分协同用意激发的神经发育窒息性疾病。血脑屏蔽（BBB）行动紧张的 “把闭者”，将处境影响传达至脑骨子，但血脑屏蔽正在自闭症发病机制中的用意正在很大水准上仍未被探明。
正在此，自闭症危害基因SHANK3正在变成血脑屏蔽的脑内皮细胞（BECs）中外达，并对庇护血脑屏蔽成效至闭紧张的慎密联贯（TJ）无缺性实行调控。内皮细胞特异性Shank3敲除的再生小鼠浮现出雄性特异性的血脑屏蔽高通透性、神经元兴奋性消浸以及超声通信受损。只管正在成年后血脑屏蔽通透性收复平常，但雄性突变小鼠仍浮现入迷经元兴奋性消浸和社交才能受损。进一步明白证据，血脑屏蔽高通透性是由eShank3基因敲除激发的β-Catenin失衡所致。这些探讨结果揭示了一种源自自闭症危害基因Shank3的致病机制，凸显了血脑屏蔽中再生脑内皮细胞行动自闭症潜正在疗养靶点的紧张旨趣。
为探究Shank3正在血脑屏蔽的脑内皮细胞（BECs）中的潜正在用意，作家对BECs中Shank3的外达情状实行了明白。通过对小鼠和人类原代BECs、BEC细胞系以及小鼠原代神经元实行PCR明白，结果显示Shank3是正在BECs中外达的独一Shank家族成员，而神经元则外达悉数三种Shank基因。经测序和PCR明白证据，正在小鼠和人类原代BECs以及BEC细胞系中，脑内皮细胞的Shank3缺失外显子18（Shank3Δe18）。该明白证据，eShank3信使核糖核酸（mRNA）正在脑血管体例的BECs中外达。接下来，作家明白了出生后发育经过中eShank3正在差异性别中的外达形式。从出生后第5天（P5）和12周龄的雄性和雌性小鼠中纯化出原代BECs。PCR和qRT-PCR明白证据，P5 BECs中再生小鼠的eShank3 mRNA外达量明显高于成年小鼠，且牝牡之间无分歧。再生儿期BECs中eShank3的大方外达证据eShank3正在性命早期的血管体例和血脑屏蔽中大概阐述用意。因为众种Shank3异构体是通过众个基因内启动子出现的，运用qRT - PCR检测法丈量了每种异构体转录本的数目，察觉 “a” 和 “b” 外面是小鼠原代BECs和bEnd.3 BEC细胞系中紧要的Shank3异构体。比拟之下，原代神经元外达的其他异构体约占40%。紧张的是，对从小鼠脑纯化的原代BECs和bEnd.3 BEC细胞系实行的免疫细胞化学明白证据，eSHANK3卵白紧要正在ZO1阳性的细胞间联贯区域外达，这证据eSHANK3正在调整BECs的联贯个性方面阐述用意，进而大概对血脑屏蔽的屏蔽成效出现影响。
图二 内皮细胞中SHANK3缺失会导致再生小鼠血脑屏蔽通透性、神经元成效及超声通信浮现缺陷
探讨证据eSHANK3正在再生儿BEC联贯处有清楚外达而且ASD常睹于婴儿期。于是，探讨职员开拓了内皮特异性Shank3 a/b敲除（KO）小鼠模子（定名为eShank3-KO），以测试eSHANK3的缺失是否会影响体内BBB的通透性。通过荧光素钠打针实习，检测到P5雄性eShank3-KO小鼠的BBB旁细胞通透性明显增长，而雌性小鼠则未侦查到此征象。进一步明白显示，雄性eShank3-KO再生儿的前额叶皮质、大脑皮质和小脑等众个脑区浮现BBB高通透性，但雌性小鼠中无此征象。免疫组化明白证据，仅正在雄性eShank3-KO小崽的内侧前额叶皮质和体感皮质区域侦查到了反响性星形胶质细胞标帜物GFAP的明显增长，提示大概存正在的性别特异性神经元成效窒息。正在电心理学实习中，察觉雄性eShank3-KO再生小鼠的举措电位频率明显消浸，这证据BBB成效窒息消浸了这些小鼠神经元的兴奋性。通过超声发声（USV）测试评估疏导缺陷，结果显示P5雄性eShank3-KO小崽发出的USV呼唤数目和均匀接续时代明显省略，而正在雌性中没有侦查到这种征象。总结来说，该探讨揭示了eSHANK3正在庇护BBB无缺性中的用意，并暗指其缺失大概导致雄性小鼠再生儿期的神经元和手脚特殊，极度是与ASD联系的症状。
正在成年eShank3-KO小鼠中，无论雄性依然雌性其BBB通透性均收复平常。别的，GFAP外达程度正在eShank3-KO和比较组Tek-Cre成年小鼠之间没有明显分歧。这些结果证据，只管再生儿期存正在BBB毁伤，但跟着年岁延长，通过某种抵偿机制，BBB通透性获得了收复。通过电流钳记实检测成年小鼠前额叶皮质（mPFC）中的GFP阳性锥体神经元的兴奋性。结果显示，成年雄性eShank3-KO小鼠的神经元举措电位频率明显低于比较组雄性小鼠，而这种低兴奋性并未正在雌性eShank3-KO小鼠中侦查到。静息膜电位正在各组小鼠之间没有明显分歧。这证据，只管BBB通透性正在成年后收复平常，但再生儿期的BBB毁伤导致的神经元成效窒息还是存正在。
运用圆形社交竞技场（RSA）范式详尽监测社会手脚，实习分为两个阶段：第一阶段，测试小鼠查究带有空内笼的竞技场；第二阶段，首肯小鼠与安放正在内笼中的社交刺激物互动。结果显示，正在社交刺激物存正在时，雄性和雌性Tek-Cre比较组及雌性eShank3-KO小鼠进入S区的频率增长。然而，雄性eShank3-KO小鼠进入S区的频率不受社交刺激物存正在与否的影响，证据雄性eShank3-KO小鼠对社交刺激物的趣味消浸。通过监控直接社交互动（嗅探手脚），悉数四组小鼠都花费更众时代嗅探社交刺激物而非空内笼。值得贯注的是，雄性eShank3-KO小鼠嗅探社交刺激物的时代明显少于雄性Tek-Cre比较组，但正在雌性小鼠中未侦查到这种分歧，证据雄性eShank3-KO小鼠的社会互动才能消浸。正在梳理毛发和埋珠实习中，雄性eShank3-KO小鼠浮现出明显增长的反复手脚。然而，正在旷场和明暗箱实习中，它们的运动成效和忧虑程度平常，证据eShank3-KO对内皮细胞的影响紧要限于雄性小鼠的社会和反复手脚。探讨证据，固然eShank3缺乏惹起的BBB毁伤仅限于再生儿期，但由此导致的神经元成效窒息和社会手脚缺陷正在成年后仍接续存正在，极度是正在雄性小鼠中。这些察觉揭示了eSHANK3正在神经体例发育中的紧张用意，并为体会ASD联系病理机制供应了新的视角。
图四 通过激活脑内皮细胞中的GSK3β收复再生儿期血脑屏蔽成效可使成年小鼠的神经成效平常化
先前探讨证据，GSK3β的激活能够收复再生儿期受损的血脑屏蔽成效，并改进成年后的神经元成效和社会手脚。作家进一步探究特异性地正在脑内皮细胞中收复平常β-Catenin信号传导是否也许改进eShank3-KO小鼠正在再生儿期的BBB成效窒息。正在出生时通过浅外颞静脉打针AAV-PHP.v1-CLDN5-GSK3βS9A-HA病毒使GSK3βS9A仅正在eShank3-KO小鼠的BECs中外达。正在P5时确认GSK3βS9A-HA正在脑内皮细胞中的特异性外达。实行BBB通透性实习，结果显示正在雄性eShank3-KO小崽中侦查到的荧光素渗漏清楚增长的征象，通过正在BECs中靶向过外达活性GSK3βS9A-HA得以收复至平常程度。这证据GSK3βS9A对由eSHANK3缺失惹起的再生儿期BBB高通透性具有挽救用意。正在雄性和雌性eShank3-KO小崽P0时通过STV打针AAV-PHP.v1-CLDN5-GSK3βS9A-HA以激活BECs中的GSK3β。
为了标帜大概受到BBB影响的兴奋性神经元，通过尾静脉打针AAV-PHP.eB-CaMKIIα-EGFP，一个月后实行电流钳记实。正在成年（17-19周龄）时明白前额叶皮质中GFP阳性锥体神经元的举措电位频率。结果显示，未过外达GSK3βS9A的情状下，雄性eShank3-KO小鼠的神经元举措电位频率明显低于Tek-Cre比较组。紧张的是，通过正在BECs中过外达GSK3βS9A，雄性eShank3-KO小鼠错杂的举措电位频率获得了收复，证据BECs特异性GSK3βS9A外达对雄性eShank3-KO小鼠的神经元低兴奋性具有挽救用意。正在雌性小鼠中，无论是否过外达GSK3βS9A，eShank3-KO小鼠和Tek-Cre比较组之间的举措电位频率没有明显分歧。别的，GSK3βS9A正在BECs中的过外达并未转折雄性和雌性eShank3-KO小鼠及Tek-Cre小鼠兴奋性神经元的静息膜电位。本探讨证据，通过正在脑内皮细胞中特异性激活GSK3β并收复平常β-Catenin信号传导，能够有用收复再生儿期受损的BBB成效，并改进成年后雄性eShank3-KO小鼠的神经元成效。这些察觉揭示了BECs正在庇护神经体例平常发育中的环节用意，并为开拓针对ASD及其他联系疾病的潜正在疗养计谋供应了新的倾向。通过早期干扰收复BBB成效，大概有助于防止或减轻历久的神经发育缺陷。
本探讨揭示了内皮细胞中的SHANK3通过β-Catenin信号通道调整再生儿期小鼠血脑屏蔽的慎密联贯，庇护BBB的无缺性安乐常成效。整体来说，eSHANK3缺乏会通过影响β-Catenin信号通道，导致慎密联贯卵白的特殊外达，进而惹起BBB高通透性。通过正在BECs中特异性激活GSK3β，能够有用收复BBB成效，并改进联系的神经元成效和社会手脚缺陷。这一察觉为体会自闭症谱系窒息等神经发育疾病的病理机制供应了新的视角，并为开拓潜正在的疗养计谋供应了外面根柢。
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